Какие компоненты входят в состав краски романовского гимза

Окраска по методу Романовского-Гимза

Краска Романовского-Гимза состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабо щелочной реакции

(pH 7,0 – 7,2) прибавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского-Гимза. Приготовленный раствор краски тотчас же наливают на фиксированный мазок или лучше предметное стекло с окрашиваемым препаратом погружают в стаканчик с краской. Через 1 ч краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окрашивание по Романовскому — Гимзе — цитологический метод окрашивания микроорганизмов, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) для изучения методом световой микроскопии.

Предложена в 1904 году Густавом Гимзой. (Раствор Гимзы для окраски по Романовскому).

Приготовление красителя

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Специальный стандартный раствор Гимза

Метиленовая синька — 1,563 г

Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:

Источник

Методика окраски по методу Романовского-Гимзы

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 м дистиллированной воды) на 10-20 мин.

Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии — в фиолетовый цвет, лептоспиры — в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Работа №3. Методы выявления микоплазм

Цель: изучить морфологию микоплазм.

Самостоятельная работа студента: используя демонстрационные таблицы, зарисовать и описать морфологию микоплазм.

Клетки микоплазм, в отличие от других прокариот, не имеют клеточной стенки, окружены ЦПМ. Снаружи ЦПМ находится капсулоподобный слой. Морфологию микоплазм изучают в живом состоянии в фазово-контрастном микроскопе и путем электронной микроскопии ультратонких срезов их клеток По Граму окрашиваются медленно, грамотрицательны.

Работа № 4. Хламидии. Морфология, цикл развития

Цель: изучить морфологию хламидий, цикл развития

Самостоятельная работа студента: используя таблицы, слайды, микропрепараты, зарисовать и описать цикл развития хламидий.

Источник

Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 0 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Методика окраски

1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.

Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза

Фиксация и методика окраски те же, что и для мазков крови. Для исследования на присутствие плазмоидиев, кроме мазков, берут обязательно и так называемую «толстую каплю». Последняя представляет собой каплю крови, размазанную по предметному стеклу углом другого стекла. «Толстую каплю» перед окраской не фиксируют.

Методика окраски «толстой капли».

1. На высохшую каплю наливают краску Романовского-Гимза, разведенную как обычно. Продолжительность окрашивания 30-50 минут.

Вариант: нефиксированную толстую каплю сушат в течение 1 ч на воздухе и окрашивают 2—10 мин смесью из 4 мл раствора Гимзы, 3 мл ацетона, 2 мл буферного раствора (рН 6,5) и 31 мл дистиллированной воды.

2. Осторожно споласкивают в дистиллированной воде и затем просушивают в вертикальном положении (фильтровальную бумагу применять нельзя).

Препарат исследуют при иммерсии. Для сохранения препаратов можно закрыть толстую каплю покровным стеклом, которое кладут на водный раствор поливинилового спирта или раствор желатина.

Ввиду того, что гемоглобин в водных растворах краски выщелачивается, эритроциты в окрашенной капле не видны. Морфология паразита в толстой капле менее ясна, чем в мазке.

Результат. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, отчетливо видна голубая протоплазма паразитов с ядром, окрашенным в розовый или красный цвет. Форма паразитов в зависимости от стадии развития может быть различной. В зрелых плазмодиях определяются темно-коричневые пигментные включения. Паразиты находятся в эритроцитах, но могут располагаться и свободно.

Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)

Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод Циля-Нильсена.

Окраска микобактерий туберкулеза карбол-фуксином по Цилю-Нильсену

Для приготовления раствора карболового фуксина 1 г основного фуксина растворяют в 2 мл глицерина и доливают до 100 мл 5 % раствором фенола. Р. Лилли (1969) рекомендует следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.

1. Наливают на фиксированный мазок карбол-фуксин Циля (окрашивают через фильтровальную бумагу) и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживают в течение 1—2 минуты, не доводя до кипения.

2. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и основательно промывают в водопроводной воде.

3. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (на 70° спирте) до тех пор, пока мазок не примет бледно-розовый или бледно-фиолетовый тон (примерно 30—60 секунд).

4. Промывают в воде 15-30 и более секунд.

5. Докрашивают метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд.

6. Основательно споласкивают в воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Мазки, перекрашенные метиленовым синим, можно дифференцировать 70° спиртом.

Такое простое окрашивание мазков на микобактерии туберкулеза практически имеет наибольшее значение. Наряду с ним, но значительно реже, применяются и другие способы: метод обогащения, посевы, прививки животным.

Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне.

Источник

ОКРАСКА ПО МЕТОДУ РОМАНОВСКОГО-ГИМЗА

Готовый краситель жидкого вида перед началом окрашивания мазков разводят в дистиллированной воде в соотношении 1-2 капель красителя на 1 мг воды. Мазки окрашиваются во влажной камере при температуре 37 °C в течение 20-25 минут. После завершения окраски мазки промываются в проточной воде, сушатся на воздухе и исследуются с помощью масляных импрессий.

Красящую смесь Романовского-Гимзы, в основе которой имеется краска Романовского Райта, растворяют в виде порошка в смеси равноправных объемах глицерина и метилового спирта в соотношении 800 мг красителя к 100 мл растворителя.

Краситель обладает плохой растворимостью, вследствие чего его следует перетереть с растворителем в количественном соотношении 300мг к 100 мг, затем, добавлять краситель при этом постоянно помешивать массу до получения требуемой концентрации. На приготовление красителя требуется несколько дней. Следует акцентировать внимание на том, что в качестве растворителей нужно применять химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как именно примеси являются причиной ухудшения свойств красителя. 100 % этиловый спирт может стать идеальной заменой метиловому спирту. Готовую красящую смесь следует хранить в плотно закрытом сосуде в прохладном сухом месте.

Специальный раствор Гимза.

Метиленовая синька (медиц.) — 1,563 г

Мазки, акцентированные в метиловом спирте, окрашивают на протяжении 40-120 минут раствором, в состав которого входят 1 мл приготовленной краски жидкой формы, 2 мл главного буферного раствора и 47 мл дистиллированной воды. Используют фосфатный буфер, на рН которого оказывает влияние вид мазка:

мазок костного мозга — 5,8 — 6,0;

малярийные плазмодия — 7,0 — 7,2.

Ополаскивание проводят в дистиллированной воде, затем высушивают и изучают при иммерсии.

Амастиготы Leishmania tropica, находящиеся – в макрофагах. Увеличение 10×100, окрашивание по Гимзе.

Бактерии вследствие окрашивания приобретают фиолетово-красный оттенок, цитоплазма клеток — голубой цвет, ядра — красный. Вследствие окраски простейших их цитоплазма становится голубого цвета, а ядра — красно-фиолетового

Материалы и методы В исследованиях использовали вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ, полученный из ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ». Микробную куль- туру, выращенную на плотной питательной среде на основе гидролизата рыбной муки с добавлением ген- цианвиолета, суспендировали в 0,9 % растворе хло- рида натрия. Оптическую плотность (ОП) суспензии доводили до 1,0 усл. ед. при длине волны 540 нм. Для измерения ОП применяли фотоэлектроколориметр КФК-2 и кюветы длиной оптического пути 5 мм. Пробы венозной крови людей получали из ФГЛУ «Кировская областная станция переливания крови», пробы крови от животных – из питомника ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ», ФГУП учхоз Вятской ГСХА «Чистые пруды», ФГУ «Кировская областная станция по борьбе с болезнями животных». В каче- стве антикоагулянтов при взятии крови применяли 3,8 % раствор лимонно-кислого натрия (1:10) или ге- парин (3 ЕД на 1 мл). В день взятия крови эритроци- ты трижды отмывали десятикратным объемом 0,9 % раствора хлорида натрия путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендирова- ли в этом же растворе. Конечную концентрацию эри- троцитов доводили до 1,0·1012/л. В пробирках смешивали по 1,0 мл суспензии эри- троцитов и по 2,5 мл суспензии бактерий. В качестве контроля использовали пробы, содержащие: 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл 0,9 % раство- ра хлорида натрия; 1,0 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Пробы вы- держивали в статических и динамических условиях (вращающаяся платформа) при (20±1) °С и (37±1) °С в течение 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мин, после центри- фугировали при 1000 об/мин в течение 3,0 мин для осаждения эритроцитов. Затем из проб отбирали на- досадочную жидкость в объеме 2,0 мл и на КФК-2 определяли значение ее ОП. Адгезивную способность бактерий оценивали по введенному нами показателю адгезии (ПА), кото- рый рассчитывали по формуле: где ПА – показатель адгезии, Дк1 – ОП надоса- дочной жидкости в контрольной пробе 1, Дк2 – ОП Микробиология, иммунодиагностика, иммунопрофилактика УДК 616.981.452:59 В.А.Оборин, Е.В.Пименов, А.Г.Ивонин Изучение адгезии бактерий вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животных фотоколориметрическим методом ГОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров С помощью фотоколориметрического метода изучены адгезивные свойства клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных. Установлено, что уровень адгезии бактерии зависит как от видовой принадлежности эритроцитов, так и от условий инкубации микробных и эукариотических клеток. Полученные данные позволяют предположить, что взаимодействие эри- троцитов с Y. pestis имеет определенное значение в развитии инфекционного процесса, обусловленного возбуди- телем чумы. Ключевые слова: адгезия, бактерии, вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ, эритроциты. МИКРОБИОЛОГИЯ, ИММУНОДИАГНОСТИКА, ИММУНОПРОФИЛАКТИКА 49 надосадочной жидкости в контрольной пробе 2, Доп – ОП надосадочной жидкости в опытной пробе. В каждой серии опытов выполняли по три не- зависимых определения; статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компью- терной программы для обработки медицинской ин- формации «Biostat 4.03». Результаты и обсуждение Известно, что при изучении адгезивных свойств бактерий важным является определение оптимальных условий их взаимодействия с клетками-мишенями [2, 3, 5]. Поэтому на первом этапе исследований изучено влияние продолжительности инкубации проб на уро- вень адгезии клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроци- там различных видов животных. Для этого эритро- циты морской свинки, белой мыши, барана, лошади и свиньи инкубировали на вращающейся платформе при температуре (37±1) °С в течение различного вре- мени, после чего определяли значения ПА (рис. 1). Как видно из рис. 1, степень адгезии бактерий зависела как от видовой принадлежности эритро- цитов, так и от продолжительности совместной ин- кубации микробных клеток с эритроцитами. В про- веденном эксперименте высокие значения ПА отме- чались в отношении эритроцитов домашней свиньи, белой мыши, морской свинки. В меньшей степени адгезия бактерий проявлялась к эритроцитам бара- на, и незначительно – к эритроцитам лошади. ПА Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам свиньи дости- гал максимального значения уже после 5 мин инку- бации. Увеличение продолжительности инкубации микроорганизмов с эритроцитами других животных до 30 мин приводило к существенному повышению уровня адгезии. При дальнейшем увеличении срока инкубации роста ПА не регистрировали. Поэтому в последующих исследованиях учет результатов адге- зии предложили проводить после 30-минутной инку- бации проб. Далее изучили влияние условий совместной ин- кубации бактерий с эритроцитами на ПА (рис. 2). При этом пробы выдерживали в статических и ди- намических условиях при различных температурных режимах. Адгезия клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроци- там домашней свиньи не зависела от температуры и условий инкубации. В то же время, прикрепление бактерий к эритроцитам других видов животных (морской свинки, белой мыши, барана и лошади) наиболее интенсивно происходило при (37±1) °С на вращающейся платформе. Следовательно, данные условия инкубации являются наиболее подходящи- ми для оценки адгезии клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животных. Выбрав оптимальные режимы инкубации (вы- держивание проб в динамических условиях при (37±1) °С в течение 30 мин), определили значения ПА в отношении эритроцитов, более широкой видо- вой принадлежности. Результаты этих исследований приведены в таблице. Анализируя данные таблицы, эритроциты раз- личной видовой принадлежности можно разделить на 3 группы в зависимости от степени адгезии к ним клеток Y. pestis EV НИИЭГ. К первой группе относят- ся эритроциты белых крыс, домашних свиней, белых мышей, морских свинок, а также людей, для которых ПА составляет свыше 60 %. Вторая группа эритро- цитов (золотистые хомячки, собаки, козы, овцы и ко- ровы) имеет ПА в пределах 40–60 %, третья (лошади, кошки) – ниже 30 %. При сопоставлении результатов определения ПА Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам людей и различных видов животных, с данными ли- тературы по их восприимчивости и чувствительности к инфицированию Y. pestis выявляется следующая закономерность: чем выше ПА, тем восприимчивее и чувствительнее к заражению возбудителем чумы является вид. Так, у людей и животных, обладающих высокой восприимчивостью и чувствительностью к инфицированию Y. pestis, ПА превышает 60 %, а жи- вотные с высокой восприимчивостью, но низкой и средней чувствительностью ПА находится на уровне 40–60 %. В то же время, у животных, имеющих ПА ниже 30 % отмечается низкая восприимчивость или чувствительность к инфицированию возбудителем чумы. Исключение составляют собаки, которые за- Рис. 1. Динамика изменения ПА Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животных при различной продолжительности инкубации проб Рис. 2. Динамика изменения ПА Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животных при различных условиях инкубации проб Проблемы особо опасных инфекций, вып. 103, 2010 50 нимают промежуточное положение между первой и второй группой, так как у них ПА ниже 60 %, но они, являясь восприимчивыми к заражению, обладают низкой чувствительностью. Таким образом, проведенные исследования по- казали, что клетки Y. pestis EV НИИЭГ обладают способностью прикрепляться к эритроцитам людей и животных. При этом установлено, что уровень ад- гезии бактерий зависит от видовой принадлежно- сти эритроцитов и от условий их взаимодействия. Выявлено, что эритроциты ряда животных прояв- ляют свою способность фиксировать бактерии в определенных условиях, что может быть обусловле- но как морфологическими, так и функциональными различиями рецепторного аппарата эритроцитов раз- личных видов млекопитающих. Экспериментальным путем выбраны оптимальные условия, позволяющие выявлять потенциальную способность эритроцитов фиксировать на своей поверхности бактерии иссле- дуемого штамма. Сравнение полученных результатов с данными литературы по восприимчивости и чувствительности к заражению возбудителем чумы человека и разных видов животных позволяет сделать предположение о том, что эритроциты играют определенную роль в восприимчивости к инфицированию Y. pestis и реа- лизации инфекционного процесса при чуме.

Источник

Оцените статью